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/http%3A%2F%2Fassets.over-blog.com%2Ft%2Ftwentyeleven%2Fimages%2Fpine-cone.jpg "Un blog pour partager mon expérience de la PCR dans le domaine de la microbiologie, les développements et les FAQ usuelles et quotidiennes que l'on peut avoir avec cette technique.")
Les molécules intercalantes : expérience et nouveautés
Publié le 17 Juin 2008
Une petite revue de détails, j'ai évoqué le test des amorces dans un post précédent avec le Sybr Green, intercalant d'ADN pour amplification non-spécifique. Voici quelques explications rapides et d'autres solutions similaires :
Le SybrGreen est une molécule (cyanine assymétrique) qui se fixe dans le petit sillon des ADN double brin. Lors de sa fixation, il émet alors une flurorescence à 525nm ce qui permet de l'utiliser sur le canal dédié à FAM en qPCR.C'est le fluorophore le plus utilisé en qPCR non-spécifique avec de très bon niveau de fluorescence.
Deux informations possibles : Quantité de cible par les courbes d'amplification (Cycle en abscisse et fluorescence en ordonnée)
Qualité de l'amplicon par les courbes de fusion. Celles-ci sont obtenues par un programme supplémentaire au thermocycle et permettre de déterminer la température de melting de chaque amplicon, qui elle-même dépend de la taille de l'amplicon et de sa composition en base. Chaque amplicon aura une Tm différente.
Le Resolight (Roche) ou LC green (pour application HRM)
Le HRM (High Resolution Melting) est une nouveauté qui utilise des intercalants ayant une densité d'insertion plus importante que le Sybr Green. En effet, le Sybr ne s'insère pas d'une manière optimum au sein de l'ADN (aux alentours de toutes les 10 bases), ce qui permet de laisser passer des informations comme les mutations ponctuelles ou les petites séquences différentes. La précision des Tm obtenues est donc moins bonne.
Avec les solutions HRM, les molécules sont insérées en contigu, donc sans laisser d'espace. C'est pour cela qu'elles sont très utiles pour le génotypage ou la moindre base de différence sera détectée. Mais pour différencier aussi des espèces, les applications peuvent être intéressantes. Ainsi, selon les séquences génétiques choisies, on peut éventuellement discerner des espèces de microorganismes par HRM sur des mutations ponctuelles.
Là encore, ces fluorophores opèrent aux alentours de 480nm d'excitation et 520nm d'émission.
Le Boxto : molécule de la famille des cyanines assymétriques type BEBO, qui se comporte comme le Sybr Green. Je ne connais pas encore la densité d'insertion de cette molécule. Je la teste au laboratoire pour le moment.
Quel est l'intéret par rapport au Sybr me direz-vous?
Et bien simplement que son spectre d'absorption/émission n'est pas aux alentours de celui du FAM (480/530nm) mais plutot celui de HEX/VIC (520/560nm). Et cela devient donc très intéressant car on peut alors réaliser des courbes de fusion avec des amplifications en sonde spécifique (si celle-ci n'utilise pas VIC/HEX ou JOE bien sur).
C'est ce que je commence à faire au labo, j'ai donc des systèmes cibles sonde greffés en FAM-BHQ, j'ajoute au mix du Boxto (qui n'interfère pas avec les autres kits du marché, mis à part peut etre ceux d'ABI), je n'oublie pas d'ajouter également au thermoprofil une étape de courbe de fusion à la fin du run... et je peux ainsi obtenir une courbe de fusion de mon amplicon après une amplification avec une sonde spécifique. Et ça marche !!!
Vous pourrez trouver les références de cette molécule sur le site du centre TATAA qui produit (http://www.tataa.com/webshop/Dyes/BOXTO/Detailed-product-flyer.html)
Ci-dessous un petit essai que j'ai réalisé il y a quelques mois.
Les cibles sont les mêmes et j'ai utilisé 4 intercalants différents ou kits
- Le boxto en rouge (signal très faible mais ici analysé dans le canal FAM et non VIC comme cela devrait être fait)
- Le Resolight en bleu (type HRM de Roche)
- Le MESA Green en noir (solution type Sybr Green de Eurogentec, mais avec un tampon optimisé)
- Le Sybr Green en vert.
On constate que les Tm obtenus sont similaires mais pas complètement.
Le Resolight donne des valeurs plus fines et des flurorescences plus fortes pour une meilleure sensibilité par rapport aux autres. Le Boxto n'est pas analysé ici de manière optimum.
Pour la suite, je vais donc tacher d'utiliser plus souvent le Resolight qui demande néanmoins un logiciel d'analyse spécifique que nous n'avons pas au labo afin d'optimiser les résultats.
Le Boxto sera lui très intéressant pour nos applications également.
Affaire à suivre
D'ici là, soyez lumineux...
Le SybrGreen est une molécule (cyanine assymétrique) qui se fixe dans le petit sillon des ADN double brin. Lors de sa fixation, il émet alors une flurorescence à 525nm ce qui permet de l'utiliser sur le canal dédié à FAM en qPCR.C'est le fluorophore le plus utilisé en qPCR non-spécifique avec de très bon niveau de fluorescence.
Deux informations possibles : Quantité de cible par les courbes d'amplification (Cycle en abscisse et fluorescence en ordonnée)
Qualité de l'amplicon par les courbes de fusion. Celles-ci sont obtenues par un programme supplémentaire au thermocycle et permettre de déterminer la température de melting de chaque amplicon, qui elle-même dépend de la taille de l'amplicon et de sa composition en base. Chaque amplicon aura une Tm différente.
Le Resolight (Roche) ou LC green (pour application HRM)
Le HRM (High Resolution Melting) est une nouveauté qui utilise des intercalants ayant une densité d'insertion plus importante que le Sybr Green. En effet, le Sybr ne s'insère pas d'une manière optimum au sein de l'ADN (aux alentours de toutes les 10 bases), ce qui permet de laisser passer des informations comme les mutations ponctuelles ou les petites séquences différentes. La précision des Tm obtenues est donc moins bonne.
Avec les solutions HRM, les molécules sont insérées en contigu, donc sans laisser d'espace. C'est pour cela qu'elles sont très utiles pour le génotypage ou la moindre base de différence sera détectée. Mais pour différencier aussi des espèces, les applications peuvent être intéressantes. Ainsi, selon les séquences génétiques choisies, on peut éventuellement discerner des espèces de microorganismes par HRM sur des mutations ponctuelles.
Là encore, ces fluorophores opèrent aux alentours de 480nm d'excitation et 520nm d'émission.
Le Boxto : molécule de la famille des cyanines assymétriques type BEBO, qui se comporte comme le Sybr Green. Je ne connais pas encore la densité d'insertion de cette molécule. Je la teste au laboratoire pour le moment.
Quel est l'intéret par rapport au Sybr me direz-vous?
Et bien simplement que son spectre d'absorption/émission n'est pas aux alentours de celui du FAM (480/530nm) mais plutot celui de HEX/VIC (520/560nm). Et cela devient donc très intéressant car on peut alors réaliser des courbes de fusion avec des amplifications en sonde spécifique (si celle-ci n'utilise pas VIC/HEX ou JOE bien sur).
C'est ce que je commence à faire au labo, j'ai donc des systèmes cibles sonde greffés en FAM-BHQ, j'ajoute au mix du Boxto (qui n'interfère pas avec les autres kits du marché, mis à part peut etre ceux d'ABI), je n'oublie pas d'ajouter également au thermoprofil une étape de courbe de fusion à la fin du run... et je peux ainsi obtenir une courbe de fusion de mon amplicon après une amplification avec une sonde spécifique. Et ça marche !!!
Vous pourrez trouver les références de cette molécule sur le site du centre TATAA qui produit (http://www.tataa.com/webshop/Dyes/BOXTO/Detailed-product-flyer.html)
Ci-dessous un petit essai que j'ai réalisé il y a quelques mois.
Les cibles sont les mêmes et j'ai utilisé 4 intercalants différents ou kits
- Le boxto en rouge (signal très faible mais ici analysé dans le canal FAM et non VIC comme cela devrait être fait)
- Le Resolight en bleu (type HRM de Roche)
- Le MESA Green en noir (solution type Sybr Green de Eurogentec, mais avec un tampon optimisé)
- Le Sybr Green en vert.
On constate que les Tm obtenus sont similaires mais pas complètement.
Le Resolight donne des valeurs plus fines et des flurorescences plus fortes pour une meilleure sensibilité par rapport aux autres. Le Boxto n'est pas analysé ici de manière optimum.
Pour la suite, je vais donc tacher d'utiliser plus souvent le Resolight qui demande néanmoins un logiciel d'analyse spécifique que nous n'avons pas au labo afin d'optimiser les résultats.
Le Boxto sera lui très intéressant pour nos applications également.
Affaire à suivre
D'ici là, soyez lumineux...