Amis de la PCR, voici la publication du mois de février que j’ai trouvée intéressante en terme de synthèse. Rien de grandement innovant dans celle-ci (ce sera pour plus tard dans les mois à venir) mais un état des lieux des paramètres à prendre en compte dans l’élaboration d’un système PCR.

Et plus particulièrement dans le choix très spécifique mais O combien important des fluorophores et des quenchers dans les sondes. En effet, sans rentrer dans les considérations purement physiques de l’interaction énergétique, des états excités ou stables, des transferts d’énergie et autres, cet article explique les détails à prendre en compte lors de la construction d’une sonde de détection pour qPCR.

Je reprends un peu ce thème déjà évoqué, mais bien explicité dans la publication dont je vous parle.

Cette publication de Marras 2006 est décomposée de la manière suivante :

Définition des modes de quenching (FRET ou contact)

Types de sondes existantes (Adjacentes, 5’-nucléase, molecular beacon, Strand-displacement)

Efficacité du transfert d’énergie

Sélection des paires fluorophores- quenchers

La publication est relativement simple à lire, je vous détaille néanmoins les informations que je trouve d’intérêt et donc à retenir et connaître :

La partie d’introduction est synthétique et définit bien comment faire la distinction entre une sonde double de proximité (LC Probes), une sonde doublement marquée d’hybridation (TaqMan), un molecular beacon à déshybridation de brin et une sonde à hybridation compétitive de brin (type Yin-Yang).

Un rappel sur l’efficacité du transfert d’énergie est réalisé (§3). On y apprend par exemple qu’un système de quenching par contact est plus efficace qu’un même système mais en quenching FRET.

Egalement, dans un quenching en FRET, les quenchers ayant un plus grand spectre d’absorption « quenchent » efficacement un plus grand nombre de fluorophores que les quenchers ayant un plus petit spectre d’absorption.

Enfin un certain nombre de conseils sont donnés pour bien choisir ses paires de fluorophores-quenchers selon le type de thermocycleurs utilisés (§4). En voici les plus intéressants :

Selon les modes d’excitation des fluorophores (Laser, lumière blanche ou diodes), l’efficacité de l’excitation est différente selon les fluorophores ciblés. Un laser Argon en lumière bleu sera moins efficace sur les fluorophores au-delà des longueurs d’onde de 540nm par exemple qu’une lumière blanche.

Si un test réalisé pour une cible unique, préférer des fluorophores ayant des longueurs d’onde comprises entre 495 et 540nm car visibles par tous les cycleurs, répondant mieux et moins onéreux.

Si choix de tests multiplex, prendre des fluorophores avec le moins de chevauchement de spectres possible, même si les cycleurs opérent des distinctions « usine » ou réalisées en laboratoire.

Un paragraphe très intéressant est consacré au rendement quantique des fluorophores (mesure de l’efficacité avec laquelle un fluorophore peut convertir la lumière absorbée en lumière émise). Ainsi, un haut rendement quantique donne de meilleures intensités de fluorescence. On apprend également que le rendement quantique est sensible au pH et à la température. Certains fluorophores sont plus sensibles à la température que d’autres. Ainsi, quand ROX ou HEX ne décroissent quasiment pas jusque 85°C, FAM décroit de manière constante mais modérée jusque 95°C et surtout Cy5 peut perdre jusque 70% de son rendement quantique dès la température de 65°C. Pour compenser cet effet, il faut alors augmenter la concentration en sonde dans le milieu réactionnel.

Enfin, un rappel succinct mais toujours aussi important est donné sur le fait de ne pas laisser un résidu Guanosine en contact direct avec le fluorophore greffé car celui-ci agit comme un quencher naturel.

Cette publication est donc à mettre entre toutes les mains de ceux qui se mettent un tant soit peu au développement de systèmes PCR, mais aussi dans les mains de ceux qui vont passer du temps à interpréter des résultats de PCR.

Bonne lecture.

Ref :

Methods Mol Biol. 2006;335:3-16.

Selection of fluorophore and quencher pairs for fluorescent nucleic acid hybridization probes.

Marras SA.

Department of Molecular Genetics, Public Health Research Institute, Newark, NJ, USA.

With the introduction of simple and relatively inexpensive methods for labeling nucleic acids with nonradioactive labels, doors have been opened that enable nucleic acid hybridization probes to be used for research and development, as well as for clinical diagnostic applications. The use of fluorescent hybridization probes that generate a fluorescence signal only when they bind to their target enables real-time monitoring of nucleic acid amplification assays. The use of hybridization probes that bind to the amplification products in real-time markedly improves the ability to obtain quantitative results. Furthermore, real-time nucleic acid amplification assays can be carried out in sealed tubes, eliminating carryover contamination. Because fluorescent hybridization probes are available in a wide range of colors, multiple hybridization probes, each designed for the detection of a different nucleic acid sequence and each labeled with a differently colored fluorophore, can be added to the same nucleic acid amplification reaction, enabling the development of high-throughput multiplex assays. It is therefore important to carefully select the labels of hybridization probes, based on the type of hybridization probe used in the assay, the number of targets to be detected, and the type of apparatus available to perform the assay. This chapter outlines different aspects of choosing appropriate labels for the different types of fluorescent hybridization probes used with different types of spectrofluorometric thermal cyclers.